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组织固定、包埋及切片实操指南 - 知乎
组织固定、包埋及切片实操指南 - 知乎首发于青子的生物杂谈切换模式写文章登录/注册组织固定、包埋及切片实操指南Clover青子生物学话题下的优秀答主如何做出一张合格的组织切片?一般要先取材→固定→透明→包埋→切片,最后进行染色组化等操作。本文着重叙述取材以后如何进行包埋和切片。包埋可分为OCT包埋(冰冻切片)与石蜡包埋。冰冻切片对于组织的抗原性保留比较好,但是形态保留比较差,一般用来做原位杂交ISH,免疫荧光IF。冰冻切片较厚一般厚度8~15μm。冰冻包埋步骤较为简洁,固定之后,直接用镊子将样品放置到样品托上,挤压OCT完全包裹组织,放入冷冻机待OCT凝固即可。凝固后就可以直接切片。如果不能及时切片,用锡箔纸包装好,放入-80℃存放。石蜡切片,一般用来做HE染色或者免疫组织化学IHC。厚度更薄,一般为4um,工艺较为复杂并且制作样本的好坏取决于不同组织的种类和组成,更加依赖制作者的经验,需要在实验过程中不断优化才能得到最佳的实验条件。下面是石蜡包埋和切片的具体步骤:一、实验材料动物组织,4%多聚甲醛(PFA),PBS,ddH2O,二甲苯,梯度乙醇,石蜡,石蜡包埋机。二、实验步骤1、取材:针对各组织部位规范化取新鲜组织,并用刀片单向切割成约3-4mm大小组织块,不要超过5mm。2、固定:将切好的组织块放入4%多聚甲醛(PFA)中固定,以组织块与4%多聚甲醛体积比 1:7为宜。PFA最好现用现配,一般在4度固定24~48h即可,固定时间因组织而异。冰冻切片可以直接用丙酮固定。其他固定液比如缓冲福尔马林PBS配的福尔马林含有K+和Na+,PH=7.4。固定的原理是采用蛋白质凝固剂,使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败,防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用,使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质,以保持原有的结构和生活时相仿。关于固定液的选择可以参考这篇文章[1]。3、洗去PFA:固定完毕后,流水冲洗3次,每次5分钟。4、脱水透明:此步骤应根据不同组织设置合适时间,基本流程如下脱水:30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇(关键步骤:可当日2H也可过夜)→95%乙醇1→95%乙醇2→无水乙醇根据不同组织大小和类型调整脱水时间,对于小鼠肝组织95%乙醇控制在30min-1H,100%乙醇5min-30min。透明:50%乙醇+50%二甲苯→二甲苯1→二甲苯2→二甲苯3利用透明剂即可以和脱水剂相混合又能和石蜡相混合的特性,可以将脱水剂替换出来,并引入石蜡到组织中。二甲苯易挥发并且有毒,该步骤在通风橱中进行。透明过程中及时观察组织形态调整透明时间,在光照下观察组织是否透明成功,透明适度即可,一般透明时间约为5min-30min。透明后放入小塑料盒子里做好标记。用于防止组织的小盒子,有孔可以让石蜡投入,对于小样本,应该用擦镜纸包裹组织防止其从小孔中漏出。5、浸蜡:将石蜡融化,温度保持在55℃左右。一共需要过三遍蜡。因第一次组织含二甲苯过多,第一次浸蜡时间尽可能短约15分钟,后两次可适当延长至30min-1h。该步骤的蜡纯度质量要求不高,但是要注意该步骤石蜡的熔点为54-56℃。用于津蜡的国产石蜡,熔点为54-56℃6、包埋:将组织块放入盛有蜡液的模具中,所需组织切面与底部平行,因蜡液在冷环境中易凝固,此步尽量要快。包埋用的石蜡因为要用于切片,对其质量和纯度和硬度的要求比较高,一般采用徕卡高熔点58-60℃的片状石蜡。用于包埋的进口石蜡包埋在包埋机上进行,包埋机有60℃的工作台和-10℃的工作台,顶部是融化后的徕卡高级石蜡,从出蜡头按压出蜡。徕卡的包埋机工作台取一个金属槽子,加入一些石蜡,然后用镊子将组织固定好,移动到-10℃的台子上,石蜡很快凝固,组织就固定在里面了,最后盖上做好标记的盖子。放在冷冻台上,约半小时后可以把铁槽取下来。不同组织大小采用不同底槽的金属包埋槽蜡液凝固虽然很快,但是刚凝固的蜡不好切,最好在四度冰箱放置过夜后再进行切片。蜡块可在4度储存很久。包埋完成后的样品在金属槽和塑料盖子内部,金属槽待半小时后可以取下来回收利用,塑料盖子和样本石蜡固定在一起。7、切片:不同组织厚度参考:肝肺心:4-6um,常规:4um,淋巴结,肾:2um。刀片锋利,使用时千万小心,日本产feather R35刀片是病理学老师推荐的最好用的刀片,但是单价十分昂贵720一盒,一盒50片。注意事项:软组织冰冻一下再切,硬组织加热后再切。石蜡切片要点和对策,戳这里[2]:切片机正面观,可以看到固定石蜡的方形卡槽,下方的滑坡固定刀片。8、展片:切好的片段用毛笔小心转移到38-40℃的展片台内的清水上,待几分钟后切片完全没有褶皱,选择组织形状完整并且没有刀痕的片子进行捞片,一个片子可以捞上两片。使用黏附载玻片,吸附能力更强。9、烤片:放入60度烘箱内烤片,烤片过夜,取出后常温保存备用。三、注意事项1、组织一定要新鲜,冻过的组织最好不要用来包埋,因为组织结构可能改变。如果进行短途运输,干冰比液氮更合适。2、组织块可根据组织特性调整大小。3、切组织块时刀片一定要锋利,及时更换并且单方向切,防止损坏组织。4、固定时间依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几时小时,有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强,作用时间应严加控制,不能过长。参考^1 https://www.biomart.cn/experiment/430/502/527/528/2285481.htm^2 https://www.91360.com/201512/76/41.html编辑于 2020-05-13 18:09生物学组织学生物实验赞同 28974 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录青子的生物杂谈科普+科研,随缘更新,目前死磕毕业论
4%多聚甲醛 - 知乎
4%多聚甲醛 - 知乎切换模式写文章登录/注册4%多聚甲醛上海多沃Dowobio4%多聚甲醛固定液(4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA Fix Solution)是一种广泛用于免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光(Immunofluorescence, IF)、免疫细胞化学(Immunocytochemistry, IC)、流式分析(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)等检测时组织、组织切片、细胞等生物样品固定的溶液。本产品配制在PBS溶液中,可直接用于组织或细胞的固定,无需稀释。若需使用低浓度多聚甲醛,可使用PBS按比例稀释。固定效果好、应用广,适用于各种常见细胞或组织的固定,对皮肤、肌肉、内脏等均有良好的固定效果,但主要作用于蛋白质,无法固定尿酸和糖类等。经反复测试,可以很好的适用于IHC、IF、IC和FACS等相关检测时样品的固定。保存说明:常温。使用说明:a. 对于细胞样品:去除培养后,按照每六孔板加入1ml固定液的比例,加入4%多聚甲醛固定液b. 对于细胞涂片、组织切片等其它细胞样品:加入固定液的量应以充分盖住样品为准c. 通常固定10-20min即可,后续需使用适当的洗涤液充分洗涤以除去残留的多聚甲醛 d. 对于组织块样品:浸泡在4%多聚甲醛固定液中,室温或4℃浸泡固定2-24h,建议不超过8h,除非组织块特别大,难以浸透。固定完成后,放入装有蒸馏水的离心管中清洗,每15-30min换一次水,共6-8次,建议在摇床上进行,或流水冲洗1-2h,随后梯度脱水,进行包埋,如果暂时不包埋,可放入70-75%的酒精中保存。注意事项:1. 本产品放置过久其中的醛基可能会被氧化为酸,使溶液pH降低,从而影响染色。2. 不同细胞或组织样品所需的固定时间有所不同,应当根据细胞或组织的种类以及组织块的大小来调整固定时间。3. 多聚甲醛虽然作用温和,但能硬化组织,固定时间过久会导致组织变脆,切片时易碎。因此固定时间通常不宜超过24小时。4. 对人体有害,操作时请小心,并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。5. 仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 Dowobio 发布于 2024-01-25 09:11・IP 属地重庆・来源官方网站聚甲醛细胞赞同添加评论分享喜欢收藏申请
实验技术干货 || 病理组织取材及固定分享 - 知乎
实验技术干货 || 病理组织取材及固定分享 - 知乎切换模式写文章登录/注册实验技术干货 || 病理组织取材及固定分享卓知生物真实、稳定、service+动物取材后,将离体组织浸入固定液,使细胞内的物质尽量保持其生活状态时的形态结构和位置,这一过程称为“固定”。组织固定在病理工作中具有重要意义,由于取材或组织固定不当造成的影响是无法弥补的。小知根据多年的动物取材及病理组织固定经验,在此和各位老师做一些交流和讨论!NO.1病理取材基本要求取材应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面保持一致,取材内容应具有代表性,根据研究目的合理选择组织、血液、体液、代谢物等。病理取材需要注意以下方面:1.组织块的厚度为2-5mm,面积1-2cm2,太大、太厚的组织块固定不充分且浪费试剂;2.对于皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条,胃肠标本应将内容物冲洗掉,以免影响组织固定、产生自溶;3.取材时应注意防止人为因素的影响,如切取组织时应使用锋利的刀片,避免用剪刀,勿选用被器械钳压过的部位,夹取组织时动作应轻柔,以免引起组织结构的变形;4.组织块上如有血液、粘液、粪便等污物,应先用生理盐水冲洗干净再取材;5.取材前要熟悉相应部位的解剖结构,快速地完成整个过程,特别是容易自溶的组织,如肠道、脑、腺体等。NO.2组织固定的目的固定的目的和作用在于:1.保持组织、细胞的结构和形态,防止离体组织自溶和细菌繁殖导致的组织腐败;2.保持定位细胞内特殊的成分,如细胞内的一些蛋白质经过固定,可沉淀或凝固定位在细胞内的原有部位;3.固定可使组织细胞中各种成分沉淀凝固并易着色,不同物质产生不同的折光率,便于区别不同组织成分;4.固定剂兼有组织硬化作用,固定后的组织硬度增加,易于切片。NO.3组织固定的注意事项1. 固定必须及时。组织一经离体后,必须立即固定(在5分钟内)。2. 固定液的选择。最常用的固定液是4%多聚甲醛液;固定液的浓度必须准确,过稀或过浓都会影响组织的形态和固定效果;要注意固定液的有效期,发现固定液变质,如多聚甲醛产生白色沉淀,应立即更换;常温固定,固定液温度过高或过低都会影响固定效果。3. 组织固定容器要选择大的,避免组织相互挤压,固定液的量要求是组织体积的5倍以上。4.固定是病理制片过程中最重要的一步,由于组织固定不佳,会造成组织腐烂、抗原丢失,将影响免疫组化的准确性,所以规范、合理的标本管理非常重要。发布于 2022-09-08 13:46实验生物实验医学赞同 101 条评论分享喜欢收藏申请
用多聚甲醛固定细胞爬片、甩片或切片 - 实验方法 - 丁香通
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首页 实验方法 细胞技术 细胞百科 用多聚甲醛固定细胞爬片、甩片或切片
用多聚甲醛固定细胞爬片、甩片或切片
用多聚甲醛固定细胞爬片、甩片或切片
关键词: 多聚甲醛 固定细胞 切片
来源: 互联网
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当纯净甲醛在水溶液中溶解时,会自动聚合成长链的多聚甲醛。其长度不一,在水中同时进行聚合与解聚反应。甲醛易溶于脂类物质,因此能穿过细胞膜进入细胞内。用多聚甲醛固定细胞时,能使细胞内的自由氨基基团发生化学交联。当不同的分子发生交联时,形成一网状结构,把细胞的各个结构成分连接起来。
单独用多聚甲醛固定细胞不能使抗体进入细胞内,在检测细胞内抗原时,标本经多聚甲醛固定后必须用非离子去污剂透化标本。
*不主张使用商业甲醛溶液作为细胞染色的固定液,因为商业甲醛实际上是甲醛和甲醇(乙醇)的混合物,甲醇和乙醇的作用是防止甲醛分子聚合,使其保持单体状态。使用商业甲醛处理细胞有两个缺陷:不具有多聚甲醛固定细胞的优点;细胞却被甲醇固定。
多聚甲醛固定方法为:
①用PBS洗涤玻片或培养皿;如果是单个的载玻片或盖玻片,用镊子镊取,放入装有PBS的烧杯中。如果载玻片或盖玻片的数量较多,将其放在专用的支架上。如果是培养皿,将PBS倒入其中洗涤;
②倒掉PBS,但勿使标本干燥;
③加入4%多聚甲醛(临用前配制),室温下静置10min;
④用PBS洗涤细胞两次;
⑤用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min(室温),有些标本可能需要长达15min,时间视抗原而定;
⑥PBS洗涤细胞4次,洗涤时间不少于5min。此时,可加入抗体。
*常见问题 :
用交联剂如多聚甲醛固定蛋白质比用有机溶剂能更好地保持细胞结构,但可能降低某些细胞组分的抗原性。经多聚甲醛固定后,与胞内自由氨基结合的抗体也许不再识别这些抗原。如果抗体在其他实验中效果良好,但在经多聚甲醛固定的标本中不能有效地作用,可以尝试逐步降低多聚甲醛的浓度。这样虽然使细胞内各成分的交联程度降低,但有利于细胞结构的保持,可以使抗体更好地与抗原中的某些结合部位接触。
*注意:
①多聚甲醛的固定是不稳定的,标本经多聚甲醛固定后应再经去污剂处理,如果标本在水溶液中浸泡的时间过长,则会使交联结构解体。因此,应避免固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长;
②若用多聚甲醛固定悬浮细胞,因为细胞呈悬浮状态,洗涤过程复杂,因此,应注意离心时间不要过长或转速太高。一般用200×g离心5min。
在免疫染色实验中,如果可用的抗体使用效果均不佳,有三种方法可以使之改善。
首先建议试用上述两种固定方法,因为这两种方法的固定机制存在很大区别。抗体在一种固定方法中检测效果不理想,有可能在另一种固定方法中工作良好。第二个解决问题的方法是降低固定液的浓度,用系列稀释的固定液进行试验。下面选择的方法虽然简单,但在非常低浓度固定液的情况下,仍能达到良好的固定效果。第三种方法是根据固定方法来制备抗体,先将抗原用固定液固定后,再去免疫动物产生抗体。在这种情况下,所用抗原将和实验中固定后的抗原非常相似,能够获得结合固定抗原的抗体。
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你所在的学校的补助在全国是什么水平? 还记得你在读研时,所在学校的补助是多少吗~?读博的也可以说说呀。我的好少,有点想哭。 101 评论
彩虹伊伊WB9C
科研汪也想有春天:告诉我你们的另一半都在哪里找的? 小伙伴们,请问你们的女(男)朋友是怎么找到的?(好给后来的朋友参考啊)是交友网站,还是七大姑八大姨介绍,还是同学自然成事?春天到了,我也想拥有一段甜甜的恋爱~看看你们可怜又可爱的小师弟小师妹吧! 41 评论
一粒会飞的沙
细胞污染 悬浮细胞复苏后培养2.3天会出现小黑点,在倒置显微镜第四挡可见细菌在活动。采用两次离心,然后加平时双倍量的抗生素,效果不佳。实验用的东西都重新高压灭菌了,培养液也重新过滤了,个人操作也更加注意了,但仍然在复苏后出现细菌,苦恼!!! 35 评论
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IHC固定技术在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。此实验方案将指导您完成固定过程。
目录 简介 细胞培养样品的固定方法 组织样品的固定方法 冷冻切片固定查看 PDF 格式的实验方案您也可以通过手机访问 Abcam App 获取我们最常用的实验方案,Abcam App 可提供多种实验方案、技术支持和实用工具,方;便现场科研工作者随时随地访问。更多信息。简介固定技术在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。固定方法的选择取决于表位和抗体本身的灵敏度,并且可能需要一些优化。我们可使用交联剂(例如多聚甲醛)进行固定。交联剂更有利于保持细胞结构,但可能降低某些细胞组分的抗原性,因为交联会阻断抗体的结合能力。此时可能需要进行抗原修复,特别是固定时间较长或使用较高浓度的交联固定剂时。细胞培养样品的固定方法福尔马林 向玻片中加入 10% 中性福尔马林缓冲液 (NPF),静置 10 分钟, 然后用 PBS 洗涤 3 次。如果在福尔马林中固定 10-15 分钟以上,则蛋白质的交联程度将升高并需要进行抗原修复,以确保抗体能自由接近蛋白质,达到结合和检测目的。乙醇 向每个玻片中加入 100–200 μL 95% 乙醇、5% 冰醋酸。 在 -20 ℃ 放置 5-10 分钟,最好置于 Coplins 瓶中, 然后用 PBS 洗涤 3 次。甲醇 向每个玻片中加入 100–200 μL 冰冷的甲醇、5% 醋酸。 在 -20 ℃ 放置 10 分钟,最好置于 Coplins 瓶中, 然后用 PBS 洗涤 3 次。乙醇和甲醇会使细胞通透化。某些抗原表位对甲醇极为敏感,因为甲醇可能会破坏表位结构。如果出现这种情况,在需要通透化时,可尝试使用丙酮代替甲醇。丙酮 向每个玻片中加入 100–200 μL 冰冷的丙酮。 在 -20 ℃ 放置 5-10 分钟, 然后用 PBS 洗涤 3 次。丙酮也会使细胞通透化,因此不需要额外的通透化步骤。组织样品的固定方法浸泡固定最常使用 10% 中性福尔马林缓冲液 (NBF)。如果数据表中说明了 IHC-P 是经测试的应用,那么除非另有说明,否则均使用此固定剂。其它固定剂的使用频率较少,例如 Bouin 溶液(多聚甲醛/苦味酸)。理想的固定时间取决于组织块大小和组织类型,但 18-24 小时的固定时间适用于大部分应用。固定不足可能导致边缘染色,即切片边缘具有强信号而中间没有信号。固定过度可能会掩盖表位;抗原恢复可帮助克服此问题,但如果组织的固定时间过长(即超过两天),那么即使进行抗原恢复也可能没有信号。灌注固定对于小组织来说,浸入固定溶液通常能获得足够的固定。但是,如果将固定溶液经由内循环系统(无论是通过心脏或通过腹主动脉)灌注,则往往能获得更快速、更均匀的固定。下文介绍了使用 4% 多聚甲醛固定大鼠的大部分器官的实验步骤。灌注固定中使用的试剂和器具麻醉剂手术用剪刀、镊子和夹钳带精细齿纹的小镊子手术刀带盖的样本瓶 (5–10 mL) 0.9% 生理盐水 500 mL 烧杯4% 多聚甲醛,固定溶液手套、护目镜灌注泵(或置于手术台上方约 150 cm 的倒置烧瓶,内装有固定剂)用于心脏主动脉灌流的带针头短注射器,长度约 50 mm,外径 1.3-1.5 mm带滴注器的灌注套件,类似于静脉输血用品通过心脏灌注固定安装灌注泵;连接灌注套件和灌注针。首先,用约 100 mL 自来水冲洗管道,去除管道中的任何残留物。然后,将灌注管的开口末端放入盛有冷的 4% 多聚甲醛的烧杯(置于冰盒中)中。溶液体积应与动物体重成比例,通常一只动物使用 200-300 mL 固定液已足够。打开阀门,将滴速调整到缓慢、稳定的速度 (20 mL/min),然后关闭阀门。做好手术准备,放置好剪刀、镊子和夹钳。向动物注射适当剂量的麻醉剂。动物麻醉后,将其面朝上放在手术台上。可使用胶带固定动物肢体,将其牢牢固定。使用捏痛反应方法确定麻醉深度。动物必须处于无反应状态,然后才可继续下一步骤。用手术刀在腹部沿隔膜切开。用锋利的剪刀切开隔膜底部的结缔组织,暴露胸壁。将大剪刀钝口朝下,沿着胸壁中线偏左剪开肋骨。在胸壁中心或两端水平剪开,打开胸腔。用夹钳打开胸腔并暴露心脏,排出血液和体液。 用镊子夹住心脏(心脏仍应跳动),将针头直接插入左心室的突起处,并向上延伸约 5 mm。注意,不要将针头插入太深,避免刺穿内壁、破坏溶液循环。将针头固定在插入点附近。打开阀门,使 0.9% 生理盐水溶液以 20 mL/min 左右的速度缓慢、稳定地滴入。用锋利的剪刀剪开心房,确保溶液能够自由流动。如果液体未自由流动,或者液体从动物的鼻腔或口腔流出,请重置针头。血液从身体排空后,将溶液更换为 4% 多聚甲醛溶液 (200–300 mL)。在更换溶液时,小心不要引入气泡。在整个灌注过程中,最好戴上护目镜。 当观察到动物出现自发运动并且肝脏颜色变浅时,灌注基本完成。(通常成年大鼠需要约 30-60 分钟的灌注时间,但具体时间因动物体重和实验技术不同而异。)停止灌注,切下目标组织。将组织放入盛有相同固定溶液的样本瓶中,在冰上或在 4 ℃ 下继续后固定 2 小时,然后进行脱水和包埋。为获得更好的结果,可在 4 ℃ 下浸泡过夜。通过腹主动脉灌注固定按上文所述准备试剂、器具和动物(步骤 1-3)。沿腹部中线切一个长切口,并向两侧延伸,打开腹腔,将肠轻轻移到动物左侧。小心暴露肾动脉起点下的主动脉,并剥离上方覆盖的脂肪和结缔组织。 用带齿纹的精密镊子在离主动脉末端分叉约 0.5-1.0 cm 处紧紧夹住主动脉壁。将弯针头在镊子附近向心脏方向插入主动脉腔中。迅速完成以下连续步骤: 1) 用小剪刀在下腔静脉上剪口2) 开始灌注3) 在肾动脉起点上方夹住隔膜下的主动脉在进行上述操作时,准确度和速度非常重要,并且固定过程最好由两个实验人员协同完成。灌注开始后,快速夹住动脉非常重要。最方便的做法是用手指(戴手套)将主动脉压到腹腔后壁上,然后用夹钳取代手指施加压力。最后,剪断按压处上方的主动脉。肾表面必须立即变白并显示均匀、苍白的颜色。对于成年大鼠,流速应至少为 60-100 mL/min。灌注 3 分钟。停止灌注,切下并修剪组织。将组织存放在样本瓶中,并浸入相同的固定剂中(后固定步骤),在冰上或 4 ℃ 固定 2 小时。为获得更好的结果,可在 4 ℃ 下浸泡固定过夜。 然后,组织可进行脱水和包埋处理。灌注固定疑难解答溶液从动物的窍孔中流出 - 针头未正确插入。尝试将针头向上插入左心房,使溶液不会流入肺中。注意,不要将针头插入过深,以免穿透内壁。可能需要多练习才能插入正确的位置,因此您可以尝试轻微移动针头,直到溶液不再从动物的鼻腔或口腔流出。固定时间太长 - 固定溶液未正确循环。确保您已将针正确夹在插入点,针孔处没有泄漏,针也没有刺穿心脏。要确认这一点很容易,您可以擦干心脏周围区域,观察固定剂是否泄漏。您也可以尝试重置针头。刺穿心脏 - 灌注固定可能不彻底,并且样品器官/组织可能未正确固定。尝试用夹钳将穿刺伤口封闭。继续灌注,并且在切下器官后,确保将器官置于相同的固定液中 2 小时以上。这种情况下,最好在 4 ℃ 浸泡过夜。如果样品器官是睾丸,在切下后,尝试向尖区(白膜层正下方)内注射一些固定剂,以便固定内部的输精管。如果注射正确,睾丸将轻微膨胀并变硬。如果您能够定位样品器官中的静脉,则可尝试向静脉中手动注射(使用注射器)固定剂。冷冻切片固定1. 将切片置于包被了 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APES) 的载片上并封片,然后在气流下风干 30-60 分钟,以尽可能完全干燥切片。2. 将切片保存在 -80 ℃ 下待用。如需获得最佳结果,请立即使用。3. 如有必要,将切片在室温下静置复温 5 分钟。4. 在室温下制备固定剂(丙酮、甲醇或乙醇)。对于新抗体,我们建议使用 3 种载片进行预实验:1) 多聚甲醛2) 丙酮3) 1:1 的丙酮:醇(甲醇或乙醇)溶液5. 用固定剂在室温下固定 15 分钟。6. 用 PBS 冲洗 3-4 次。7. 如果用丙酮固定,则需在气流下风干 30 分钟,以达到完全干燥。8. 按免疫组化染色实验方案继续后续处理。如果用于免疫荧光实验的组织样本需要使用醛固定剂(多聚甲醛、戊二醛等)固定,则需在封闭液中加入 0.3 M 甘氨酸,然后加入一抗。甘氨酸能够结合游离醛基,避免醛基结合一抗和二抗,使背景偏高。当选用戊二醛或多聚甲醛作为固定剂时,易出现游离醛基导致的高背景。查看更多 IHC 实验方案观看简单易懂的实验方案视频。
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